Калькулятор спектроскопії

Спектроскопія - це розділ фізики та аналітичної хімії, що вивчає взаємодію електромагнітного випромінювання з речовиною. Основою кількісного спектрофотометричного аналізу є закон Бера-Ламберта (закон Бугера-Ламберта-Бера), який встановлює лінійну залежність між оптичною густиною (поглинанням) розчину та концентрацією речовини. Закон був сформульований П'єром Бугером (1729), Йоганом Ламбертом (1760) та Августом Бером (1852). УФ-видима спектроскопія (200-800 нм) широко використовується для визначення концентрації забарвлених та хромофорних сполук: білків (280 нм, ароматичні амінокислоти), нуклеїнових кислот (260 нм, пуринові/піримідинові основи), ферментативних реакцій (NADH 340 нм), аналізу домішок у фармпрепаратах. Інфрачервона спектроскопія (ІЧ, 2.5-25 мкм) характеризує функціональні групи органічних молекул. Раманівська спектроскопія виявляє симетричні коливання, недоступні для ІЧ. Атомно-абсорбційна спектроскопія (ААС) визначає концентрацію металів (ppm рівні). Флуоресцентна спектроскопія має дуже високу чутливість завдяки вимірюванню емісії світла. Оптична густина A (absorbance) пов'язана з пропусканням T (transmittance): A = -log₁₀(T) = -log₁₀(I/I₀). Коефіцієнт молярної екстинкції ε характеризує здатність речовини поглинати світло на певній довжині хвилі. Наш калькулятор дозволяє обчислювати концентрацію, оптичну густину, пропускання за законом Бера-Ламберта для спектрофотометричного аналізу.

Калькулятор спектроскопії

Концентрація за законом Бера-Ламберта

Типовий діапазон: 0.1 - 1.0
Наприклад, NADH (340 нм): 6220 М⁻¹·см⁻¹
Стандартна кювета: 1 см

Основні формули спектроскопії

Закон Бера-Ламберта

A = ε · c · l

де:
A - оптична густина (absorbance, безрозмірна)
ε - коефіцієнт молярної екстинкції (М⁻¹·см⁻¹ або л·моль⁻¹·см⁻¹)
c - концентрація (М або моль/л)
l - товщина кювети, довжина оптичного шляху (см)

Концентрація: c = A / (ε · l)

Пропускання та оптична густина

T = I / I₀
T% = (I / I₀) × 100%

A = -log₁₀(T) = -log₁₀(I/I₀) = log₁₀(I₀/I)
T = 10-A

де:
T - пропускання (transmittance, від 0 до 1)
I₀ - інтенсивність падаючого світла
I - інтенсивність пропущеного світла

Концентрація нуклеїнових кислот

дволанцюгова ДНК (dsDNA): c (мкг/мл) = A₂₆₀ × 50 × фактор розведення
одноланцюгова ДНК (ssDNA): c (мкг/мл) = A₂₆₀ × 33 × фактор розведення
РНК (RNA): c (мкг/мл) = A₂₆₀ × 40 × фактор розведення

Чистота:
ДНК: A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8 (чиста)
РНК: A₂₆₀/A₂₈₀ = 2.0 (чиста)
Забруднення білком: A₂₆₀/A₂₈₀ < 1.8

Концентрація білка за поглинанням при 280 нм

c (мг/мл) = A₂₈₀ / ε₂₈₀

ε₂₈₀ можна розрахувати за вмістом Trp та Tyr:
ε₂₈₀ = n(Trp) × 5500 + n(Tyr) × 1490

де n - кількість залишків амінокислот у білку

Розведення

c₁ × V₁ = c₂ × V₂
A₁ × V₁ = A₂ × V₂

Фактор розведення: DF = V₂ / V₁ = A₁ / A₂
Об'єм розчинника: Vрозчинник = V₂ - V₁

Адитивність оптичної густини

Aсуміші = A₁ + A₂ + A₃ + ... + Aₙ

Для багатокомпонентного аналізу при різних довжинах хвиль

Застосування спектроскопії

Біохімія та молекулярна біологія

  • Визначення концентрації білка - A₂₈₀ (ароматичні амінокислоти), методи Бредфорда, Лоурі, BCA
  • Кількісна оцінка нуклеїнових кислот - ДНК/РНК при 260 нм, чистота A₂₆₀/A₂₈₀
  • Ферментативна кінетика - спостереження за NADH (340 нм), субстратами, продуктами
  • Денатурація білків - зміна спектру при розгортанні

Аналітична хімія

  • Кількісний аналіз - визначення концентрації іонів (Fe³⁺, Cu²⁺, комплекси)
  • Фармацевтичний аналіз - визначення вмісту діючої речовини, домішок
  • Екологічний моніторинг - нітрати, фосфати, важкі метали у воді
  • Харчова промисловість - барвники, консерванти, вітаміни

ІЧ-спектроскопія

  • Ідентифікація функціональних груп - O-H (3200-3600), C=O (1650-1750), N-H, C-H
  • Структурний аналіз органічних сполук - "відбиток пальця" молекули
  • Контроль полімерів - склад, ступінь кристалічності
  • Вторинна структура білків - α-спіраль, β-листок (амід I, II)

Флуоресцентна спектроскопія

  • Високочутливий аналіз - концентрації до 10⁻¹² М
  • Мічення біомолекул - GFP, флуоресцеїни, родаміни
  • FRET - вивчення білок-білкових взаємодій
  • Діагностика - імунофлуоресценція, проточна цитометрія

Атомно-абсорбційна спектроскопія (ААС)

  • Визначення металів - Ca, Mg, Fe, Cu, Zn, Pb, Cd у ppm/ppb
  • Клінічна діагностика - макро- та мікроелементи у крові, сечі
  • Екотоксикологія - важкі метали у ґрунті, воді, рослинах

Практичне значення та контекст

Коротка довідка

Снелль відкрив закон заломлення (1621), Ньютон розклав світло у спектр. Максвелл довів електромагнітну природу світла (1865).

Де застосовується

Медицина: мікроскопія, лазерна хірургія, офтальмологія. Телекомунікації: оптоволоконні лінії зв'язку. Астрономія: телескопи, спектроскопія зірок. Фотоніка: лазери, оптичні процесори.

Часті запитання (FAQ)

Чому закон Бера-Ламберта не завжди діє?
Закон Бера-Ламберта справедливий для розведених розчинів (A < 1), монохроматичного світла, відсутності хімічних реакцій та розсіювання. Відхилення спостерігаються при:
1) Висока концентрація (> 0.01 M) - міжмолекулярні взаємодії, зміна показника заломлення
2) Поліхроматичне світло - різні ε на різних λ
3) Флуоресценція чи фосфоресценція зразка
4) Розсіювання світла (мутні зразки, суспензії)
5) Хімічні реакції (асоціація, дисоціація, таутомерія)
6) Блукаюче світло у спектрофотометрі
Який оптимальний діапазон оптичної густини?
Оптимальний діапазон: A = 0.2 - 0.8 (іноді 0.1 - 1.0). При A < 0.1 похибка велика через мале співвідношення сигнал/шум. При A > 1.0 мало світла проходить (T < 10%), велика похибка вимірювання. Якщо A виходить за межі, потрібно розвести або концентрувати зразок. Найменша похибка при A ≈ 0.434 (T = 36.8%).
Як правильно виміряти концентрацію ДНК?
1) Розведіть ДНК так, щоб A₂₆₀ = 0.1-1.0 (зазвичай 1:50 - 1:100)
2) Виміряйте A₂₆₀ та A₂₈₀ у кварцовій кюветі (1 см) проти буферу
3) Перевірте чистоту: A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8±0.1 (чиста ДНК). Якщо < 1.8 - забруднення білком, > 2.0 - РНК
4) Розрахуйте: c = A₂₆₀ × 50 × фактор розведення (мкг/мл)
5) Для молярності: M = (c мкг/мл) / (660 г/моль × довжина bp) × 10⁶
Альтернатива: флуориметричний метод (PicoGreen, Qubit) - вища специфічність.
У чому різниця між оптичною густиною та пропусканням?
Пропускання (T) - це відношення інтенсивності пропущеного світла до падаючого: T = I/I₀ (від 0 до 1 або 0% до 100%). Оптична густина (A) - логарифмічна міра: A = -log₁₀(T). A пропорційна концентрації (закон Бера-Ламберта), тому зручніша для кількісного аналізу. Приклади: T=100% → A=0 (розчин прозорий), T=10% → A=1, T=1% → A=2. При збільшенні концентрації вдвічі, A подвоюється, а T зменшується квадратично.
Чому білки поглинають при 280 нм?
Білки поглинають УФ-світло при 280 нм через ароматичні амінокислоти: триптофан (Trp, ε₂₈₀ = 5500 М⁻¹·см⁻¹), тирозин (Tyr, ε₂₈₀ = 1490 М⁻¹·см⁻¹), фенілаланін (Phe, слабко). Максимум поглинання пептидного зв'язку - 190-220 нм (далекий УФ). Вимірювання при 280 нм просте, не потрібні реагенти, але неточне для білків без Trp/Tyr (колаген, желатин). Співвідношення A₂₈₀/A₂₆₀ < 0.6 вказує на забруднення нуклеїновими кислотами.
Навіщо потрібен blank (холостий контроль)?
Blank (бланк, холостий зразок) - це кювета з розчинником без аналіту. Вона компенсує поглинання розчинника, буферу, кювети, відображення на стінках. Спектрофотометр "обнуляється" на бланку (встановлення A=0 або T=100%). Без бланку результати будуть неточні. Бланк має містити всі компоненти, крім досліджуваної речовини. Для ферментативних реакцій використовують "реакційний бланк" без ферменту.

📁 Категорія: Хімія